Terreni per la crescita ottimale e la raccolta di cellule di Escherichia coli
LB media - I terreni colturali più comuni per la crescita di Escherichia coli sono gli LB media (Luria-Bertani). Questi terreni, sebbene siano stati già descritti negli anni ’50 nei primi giorni della ricerca sui fagi, sono tuttora largamente impiegati in biologia molecolare.
I due principali ingredienti dei terreni LB sono il triptone e l’estratto di lievito. Il triptone si impiega ad una concentrazione di 10 g/l e l’estratto di lievito ad una concentrazione di 5 g/l. Le varie formulazioni dei terreni LB differiscono per la concentrazione del cloruro di sodio NaCl. Tutti i terreni LB sono elencati in ordine di crescente concentrazione di NaCl.
Il terreno LB Miller è il terreno High Salt LB Medium con 10 g/l mentre il terreno LB Lennox è il terreno LB Low Salt con 5 g/l. L-Broth contiene solo 0,5 g/l NaCl ed è utilizzato principalmente per lavorare con il phage P1, laddove CaCl2 è aggiunto per un’efficiente aderenza del phage alla cellula. Nei terreni LBM Mg2+ è aggiunto per incrementare l’assorbimento di phage lambda alle cellule. Il triptone e l’estratto di lievito non contengono una quantità sufficiente di Mg2+ per un assorbimento ottimale.
Numerosi e differenti tipi di terreni colturali LB presentano sinonimi. Abbiamo tentato di elencarli tutti.
Nel caso in cui non riusciate a trovare un terreno, provate a cercarlo con il sinonimo.
Tryptone Broth è un terreno moderatamente ricco per la crescita e la coltivazione di Escherichia coli .
Terrific Broth è un terreno più ricco rispetto ai terreni LB e Tryptone media. Il terreno è stato ideato per una pià alta densità di crescita di cellule di Escherichia coli ed una più elevata raccolta di DNA plasmidico rispetto ad LB a Tryptone Broth.
Super Broth è un terreno ancora più ricco ideato per ottenere elevati raccolti di bacteriophage lambda nei lisati liquidi, Botstein, D. et al.
Preparazione
dei terreni colturali e conservazione
L’efficacia e la qualità dei terreni, dopo che sono stati preparati,
dipende dalle tecniche di reidratazione e dall’immagazzinamento.
Pertanto è molto importante seguire alcune raccomandazioni.
I terreni pronti in polvere sono igroscopici e devono essere protetti
dall’umidità atmosferica. Dopo aver prelevato dal flacone la
quantità di terreno necessaria per l’esperimento, il flacone
dovrà essere accuratamente richiuso. I terreni si conservano a
temperatura ambiente in un luogo asciutto.
La preparazione dei terreni in forma concentrata non è
raccomandata. Alcuni sali e complessi proteici possono precipitare in
una soluzione concentrata
Aggiungere
la quantità necessaria di terreno disidratato a metà
della quantità di acqua occorrente. L’acqua è bene
che sia distillata o deionizzata. La miscela deve venire agitata con
energia fino a quando la polvere non sarà completamente
dissolta. L’acqua rimasta sarà utilizzata per dilavare le
pareti del recipiente , avendo cura di mantenere agitata la miscela.
Quando è necessario si mette la miscela sul fuoco diretto,
importante è che sia lento. Per evitare che la polvere
caramelli lungo le pareti del recipiente è utile agitare con
regolarità la miscela. Naturalmente il recipiente deve essere
di dimensioni opportune: circa due o tre volte il volume della
miscela in preparazione.
I
terreni arricchiti con gelificanti (agar) devono venire riscaldati
prima della sterilizzazione in autoclave. I terreni a base di agar
devono venire portati ad ebollizione , questo perché l’agar
gelifica in modo irreversibile quando la temperatura dell’acqua
raggiunge i 98-100°C. Prima di portare ad ebollizione la miscela
è bene lasciare la miscela a riposare per 5 – 10 minuti,
così da assicurare che la gelificazione e la distribuzione
siano omogenee.
Una
raccomandazione è quella di togliere dal fuoco la miscela non
appena comincia a bollire, lasciandola riposare un attimo ed
agitandola con energia. Questo è bene ripeterlo 2 o 3 volte,
sempre mantenendo la miscela in agitazione. Lo scioglimento dell’agar
sarà completo quando non compariranno più grumoli nella
miscela.
Lo
scioglimento del terreno direttamente in autoclave mentre avviene la
sterilizzazione è una pratica dannosa e sempre da evitare.
Infatti in questo modo si altera la qualità del terreno e
sono frequenti concentrazioni disomogenee nonché imbrunimenti
e variazioni di pH.
I
terreni colturali vanno sterilizzati in un’autoclave validata a
121°C per 15 minuti (15 psi ). Temperature più alte o un
tempo di trattamento termico più lungo del previsto possono
provocare imbrunimenti a seguito della caramellizzazione degli
zuccheri. Inoltre può avvenire la denaturazione delle
proteine. Entrambi questi fattori causano una crescita stentata delle
cellule dei microrganismi.
Riferimenti: Botstein,
D. et al. Mol.Biol., 91, 439, (1975). Lennox,
E.S., Virology, 1, 190, (1955). Luria,
S.E. and Burrous, J.W., J.Bateriol. 74, 471, (1957). Luria,
S.E. et al., Virology, 12, 348, (1960)Blattner,
F., et al. Science,
196, 161, (1977).Miller,
J.H., Experiments in Molecular genetics, C.S.H., Press, N.Y., (1972).
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