Terreni colturali per Escherichia coli

Terreni per la crescita ottimale e la raccolta di cellule di Escherichia coli

LB media - I terreni colturali più comuni per la crescita di Escherichia coli sono gli LB media (Luria-Bertani). Questi terreni, sebbene siano stati già descritti negli anni ’50 nei primi giorni della ricerca sui fagi, sono tuttora largamente impiegati in biologia molecolare. I due principali ingredienti dei terreni LB sono il triptone e l’estratto di lievito. Il triptone si impiega ad una concentrazione di 10 g/l e l’estratto di lievito ad una concentrazione di 5 g/l. Le varie formulazioni dei terreni LB differiscono per la concentrazione del cloruro di sodio NaCl. Tutti i terreni LB sono elencati in ordine di crescente concentrazione di NaCl. Il terreno LB Miller è il terreno High Salt LB Medium con 10 g/l mentre il terreno LB Lennox è il terreno LB Low Salt con 5 g/l. L-Broth contiene solo 0,5 g/l NaCl ed è utilizzato principalmente per lavorare con il phage P1, laddove CaCl2 è aggiunto per un’efficiente aderenza del phage alla cellula. Nei terreni LBM Mg2+ è aggiunto per incrementare l’assorbimento di phage lambda alle cellule. Il triptone e l’estratto di lievito non contengono una quantità sufficiente di Mg2+ per un assorbimento ottimale. Numerosi e differenti tipi di terreni colturali LB presentano sinonimi. Abbiamo tentato di elencarli tutti. Nel caso in cui non riusciate a trovare un terreno, provate a cercarlo con il sinonimo.

Tryptone Broth è un terreno moderatamente ricco per la crescita e la coltivazione di Escherichia coli .

Terrific Broth è un terreno più ricco rispetto ai terreni LB e Tryptone media. Il terreno è stato ideato per una pià alta densità di crescita di cellule di Escherichia coli ed una più elevata raccolta di DNA plasmidico rispetto ad LB a Tryptone Broth.

Super Broth è un terreno ancora più ricco ideato per ottenere elevati raccolti di bacteriophage lambda nei lisati liquidi, Botstein, D. et al.

Preparazione dei terreni colturali e conservazione

L’efficacia e la qualità dei terreni, dopo che sono stati preparati, dipende dalle tecniche di reidratazione e dall’immagazzinamento. Pertanto è molto importante seguire alcune raccomandazioni.

I terreni pronti in polvere sono igroscopici e devono essere protetti dall’umidità atmosferica. Dopo aver prelevato dal flacone la quantità di terreno necessaria per l’esperimento, il flacone dovrà essere accuratamente richiuso. I terreni si conservano a temperatura ambiente in un luogo asciutto.

La preparazione dei terreni in forma concentrata non è raccomandata. Alcuni sali e complessi proteici possono precipitare in una soluzione concentrata

Aggiungere la quantità necessaria di terreno disidratato a metà della quantità di acqua occorrente. L’acqua è bene che sia distillata o deionizzata. La miscela deve venire agitata con energia fino a quando la polvere non sarà completamente dissolta. L’acqua rimasta sarà utilizzata per dilavare le pareti del recipiente , avendo cura di mantenere agitata la miscela. Quando è necessario si mette la miscela sul fuoco diretto, importante è che sia lento. Per evitare che la polvere caramelli lungo le pareti del recipiente è utile agitare con regolarità la miscela. Naturalmente il recipiente deve essere di dimensioni opportune: circa due o tre volte il volume della miscela in preparazione.

I terreni arricchiti con gelificanti (agar) devono venire riscaldati prima della sterilizzazione in autoclave. I terreni a base di agar devono venire portati ad ebollizione , questo perché l’agar gelifica in modo irreversibile quando la temperatura dell’acqua raggiunge i 98-100°C. Prima di portare ad ebollizione la miscela è bene lasciare la miscela a riposare per 5 – 10 minuti, così da assicurare che la gelificazione e la distribuzione siano omogenee.

Una raccomandazione è quella di togliere dal fuoco la miscela non appena comincia a bollire, lasciandola riposare un attimo ed agitandola con energia. Questo è bene ripeterlo 2 o 3 volte, sempre mantenendo la miscela in agitazione. Lo scioglimento dell’agar sarà completo quando non compariranno più grumoli nella miscela.

Lo scioglimento del terreno direttamente in autoclave mentre avviene la sterilizzazione è una pratica dannosa e sempre da evitare. Infatti in questo modo si altera la qualità del terreno e sono frequenti concentrazioni disomogenee nonché imbrunimenti e variazioni di pH.

I terreni colturali vanno sterilizzati in un’autoclave validata a 121°C per 15 minuti (15 psi ). Temperature più alte o un tempo di trattamento termico più lungo del previsto possono provocare imbrunimenti a seguito della caramellizzazione degli zuccheri. Inoltre può avvenire la denaturazione delle proteine. Entrambi questi fattori causano una crescita stentata delle cellule dei microrganismi.

Riferimenti: Botstein, D. et al. Mol.Biol., 91, 439, (1975). Lennox, E.S., Virology, 1, 190, (1955). Luria, S.E. and Burrous, J.W., J.Bateriol. 74, 471, (1957). Luria, S.E. et al., Virology, 12, 348, (1960)Blattner, F., et al. Science, 196, 161, (1977).Miller, J.H., Experiments in Molecular genetics, C.S.H., Press, N.Y., (1972).